NuHi? eRT逆轉錄酶

NuHi® eRT逆轉錄酶    貨號:NH9011

NuHi® eRT是通過對M-MLV Reverse Transcriptase突變改造獲得的全新逆轉錄酶,具有較高的延伸性、反應效率,同時支持高溫反應。對于GC含量高或者具有二級結構的RNA模板也具有較好的兼容性。

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  • 技術參數
  • 常見問題
  • 相關資料
NuHi® eRT是在莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia virus,M-MLV) 基礎上經過多點突變得到的新型逆轉錄酶,適用于常規RNA、富含GC區域或具有復雜二級結構RNA模板的逆轉錄。能夠有效合成長達14.8kb*的cDNA。具有優異的熱穩定性,帶來更高的cDNA產量及靈敏度。通過突變改造,去除了RNase H的活性,提升反應效率,同時增強逆轉錄產物的穩定性。
NuHi® eRT對于常見的逆轉錄抑制劑具有較好的抗抑制特性。(這些抑制劑通常是RNA提取試劑的組分,或來源于樣品,在提取過程中會有不同程度的殘留,如異硫氰酸胍、乙醇、木聚糖、EDTA、SDS、CTAB)。

產品規格

試劑成分 2000U 10000U 50000U
NuHi® eRT 10μL 50μL
250μL
5x NuHi® eRT Buffer 500μL 1000μL
5x 1000μL
100 mM DTT 100μL
500μL
5x 500μL



本部分針對在實驗中出現的常見問題給出可行的解決方案。如果出現其他問題或者使用推薦的解決方案無法解決,歡迎聯系我司技術支持,他們將與您進行更詳細的討論,解決出現的問題。

常見問題

解釋或解決方案

cDNA產物或產量少

a.配置條件

配置Mix時在需在冰上操作

b.將過多的反轉錄后產物加入PCRqPCRMix

將過多的反轉錄產物加入PCRqPCRMix中,可能會降低擴增效率。建議僅加入不超過最終PCR體積的10%的逆轉錄反應產物。

c.反應溫度

逆轉錄反應條件應處于42~55°C,確保設置的溫度正確且PCR儀或其他加熱設備的溫度準確。正常情況下建議使用42~50℃進行反應,在極少數情況下,當用于反應的RNA具有高度的二級結構時,可以使用55℃作為反應溫度(最高不超過60℃)。但是溫度越高,eRT的活性損失越快,會影響最終產物的總量。

d. 加樣錯誤

檢查是否有漏加試劑或者移液器加樣體積錯誤等情形。按標準流程重復一次進行驗證。

e.試劑的準備

所有試劑融化后進行混勻,并迅速置于冰上靜置。保證所有試劑,特別是酶,處于低溫狀態。

f. 模板質量差或總量不足

檢查RNA模板的濃度、完整性和純度(見附件IIRNA的濃度、純度、完整性與儲存)。
在逆轉錄mix配置時需加入終濃度為0.5-2U/μLRNase抑制劑(依據RNase污染程度可以做調整),確保反應中不受RNase的影響。任何微量的RNase都會導致RNA模板的降解,影響最終產物的總量及長度。

g. 模板濃度過高或過低

NuHi® eRT可用于逆轉錄10pg – 2.5μg的總RNA10fg – 250ngmRNA
超過推薦的 RNA模板量,建議擴大反應體系。
對于過低的RNA模板,可能會產生非特異。

h.模板降解

不恰當的保存(如常溫保存)或RNase污染會導致RNA模板降解。模板降解嚴重可能會導致產物量降低。
在進行模板預變性時,若由于變性溫度過高(>65℃)或變性時間過長(>5min),也會導致RNA模板降解,從而使得產物量降低。

i. 引物量不合適或引物降解

在進行逆轉錄前,建議先對引物進行質檢(附件III),確定引物的真實濃度和完整性。在初次使用NuHi® eRT時,建議對引物進行梯度嘗試。Oligo dT引物和隨機引物的終濃度建議為0.1—1.0μM,特異性引物的終濃度建議為2.5—10μM

j. 反應時間過短

正常反應時間保持在15min-30min。若產物片段過長或具有復雜的二級結構,在溫度保持在42-50℃時,建議適當延長反應時間。

cDNA片段過短

a.通用原因

cDNA產物或產量少d.-j.的解決方案

b.反應溫度過高

過高的反應溫度會降低產物cDNA的長度。確保設置的溫度正確且PCR儀或其他加熱設備的溫度準確。

c. 反應后逆轉錄酶失活步驟

對于長片段產物的逆轉錄,不建議在反應結束后進行逆轉錄酶失活處理的步驟,因為高溫可能導致DNA鏈斷裂。

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